苏三经营运输业，是天地会的成员。婚后不久，苏三被同行杀害。他手下的一群年青的搬运工人和强悍的船夫劝说苏三娘出面，带领他们为苏三报仇。苏三娘带着他们到天地会请求帮助，天地会拨了500会众交由她指挥，不几天便杀了仇家，烧了凶手的家宅。于是苏三娘成了官府通缉的“女匪”。苏三娘从此拉起一支精壮的队伍，劫富济贫，锄强扶弱，驰骋于横县、钦州、灵山一带。队伍扩至数千人，她成为天地会的首领之一。

道光二十九年（1849）冬，她率天地会2000多人到武宣东乡墟加入太平军，参加金田起义，跟随洪秀全转战沙场，立下汗马功劳，位至女军军帅。在守永安、围桂林、打长沙、攻武汉、破南京等战役中，她英勇善战，所向披靡。连清朝当朝状元龙启瑞也为之倾倒，曾赋诗《苏三娘行》，赞她“两臂曾经百余战，一枪不落千人后”，“驰马呼曹意气豪”，“万千狐鼠纷藏逃”。1853年3月20日，她威风凛凛地率兵开进南京城时，龙诗写到：“城头鼓角声琅琅，牙卒林立旌旗张，东家西家走且僵，路人争看苏三娘。”

入南京城后，苏三娘曾任女营副总管，协助洪宣娇管理女营。咸丰三年（1853年），苏三娘奉命与罗大纲各率男女军攻打镇江，战斗中她冲锋陷阵，飞身登城，其英雄事迹不胫而走，时有诗云：“绿旗黄幌女元戎，珠帽盘龙结束工；八百女兵都赤脚，蛮衿紥袴走如风。”

夺取镇江后，苏三娘又奉命镇守镇江，指挥女军多次粉碎了官兵的反扑。令人费解的是，咸丰四年（1854年）之后，威名赫赫的女将苏三娘从人们的视野中消失了，史籍中关于她的记载几乎不见了。《天国志·列女传》对她最后的记载是，“乙荣五年（太平天国历，即1855年）嫁与罗大纲，自后无闻”。