明清两广总督府驻肇庆共182年，这一时期在肇庆和澳门的历史发展中都具有极其重要的地位。肇庆和澳门是这一时期岭南地区最重要的城市。明清时，澳门归两广总督府管辖，肇庆是两广总督府所在地，两地的往来如走亲戚。资料显示，至今澳门有超过三万人的籍贯是肇庆。在近两百年的历史中，明代中叶两广总督府设置澳门为中国对外商埠一事对岭南和中国历史发展产生了深远的影响。
明代中叶，有侵略野心的葡萄牙人吸收了历次被中国军民驱逐的教训，不得不尊重中国的主权，开始调整他们的对华贸易政策。而明两广总督府也逐渐意识到，如果只着眼于整顿国防，不给中外商人以正常贸易的机会，自身也会陷入难以解脱的困境。随着中国对外贸易规模的扩大，至明代中叶，历史向中国人提出了这样的要求∶离开广州城不远，在珠江出海口附近，寻找一块面积足够大的地域，设置一个既有利于对外贸易管理，又利于国防安全，方便外船靠泊与外商开展正当贸易活动，并使舶市和商埠连在一起的特殊经济行政区域。经过长时间考察，两广总督最终选定了澳门。经过葡萄牙代表到肇庆拜会明代两广总督及其指派代表，并经多次会谈、交锋，万历十年(1582年)在肇庆正式签订了协议。一方面，中国对澳门行使主权，实施领土、军事、行政、司法和关税的全面管治；另一方面，允许澳门的葡商及其经纪人享有适当的自治之权。澳门葡人正式每年缴纳地租五百两白银给中国政府。
嘉靖四十三年(1564年)，两广提督吴桂芳正式开府肇庆。万历十年(1582年)，驻澳葡萄牙人派出首席检察官本涅拉和传教士罗明坚到肇庆。罗明坚还趁机请求总督给他安排一个居留地。陈瑞表示“以后再来，可以答应这个要求”。澳门教会遂于同年十二月派传教士罗明坚、司铎柏范齐、译员门代，经三水到达肇庆。四个月后，陈瑞因事褫职，他担心引外夷入居会增加自己的罪状，因此在被解职北上之前，命罗明坚和柏范齐迅速离开肇庆。
万历十一年(1583年)八月中旬，肇庆知府王泮派人到澳门，向教会递交信件，同意传教士重返肇庆，还可以给地建房。教会遂即决定派遣罗明坚为主角，利玛窦为副手，另外还有一个澳门籍的教徒当翻译，于农历九月十日到达肇庆。
利玛窦(1552-1610)，号泰西，又号西江，出生于意大利马寨拉塔市，曾在日耳曼大学读法律，又在罗马学院读哲学和神学。万历三年(1575年)被派到东方传教。1583年9月，利玛窦等人从澳门取水道沿西江而上，进入了当时南方政治、经济、文化中心的“两广总督府”所在地肇庆，在西江边上建起了“仙花寺”定居，从此揭开了明清之际东西方文化交流的历史新篇章。利玛窦初到肇庆，就开始介绍西方的科学。他向肇庆人介绍了数学等方面的知识，引起了人们的好奇，取得了结交中国人的机会。利玛窦在中国的28年里，从澳门到肇庆，辗转各地，所到之处都用传播西方数学、地理和天文等知识开路，在客观上则起到了传播西方文明的作用，尤其是把西方的数学传入中国，从而推动了中国数学向前发展，因此赢得了数学家的美誉。
到达肇庆后，罗明坚与利玛窦暂住在天宁寺附近的陈理阁家，他们佛服佛装，自称西僧，每天在寓所举行弥撒。他们选择了在建崇禧塔附近的一块地皮建教堂，书报告呈递知府王泮。
王泮将罗明坚和利玛窦的请求转呈郭应聘，经批准，传教士开始在肇庆建筑教堂。万历十二年(1584年)，新任两广总督吴文华批准在肇庆设立对澳门管理负有重大责任的分巡海道副使驻地海防馆，并授予驻澳佛郎机人长官以“夷目”一职。这样一来，罗明坚和利玛窦在肇庆更为活跃。
万历十三年(1585年)夏季，中国大陆第一间天主教堂正式在肇庆城区落成，王泮为教堂送来他亲笔题字的两块匾额以示祝贺。一块上书“仙花寺”，挂于教堂门首；一块上书“西来净土”，挂于当中圣堂。利玛窦则自署“圣童贞院”。从王泮送来的匾额可以看出，他对建筑教堂态度是积极的，并且希望教堂能发挥良好的作用，除邪匡正，净化社会上的污泥浊水。
罗明坚、利玛窦在肇庆期间，为沟通中西文化做了一些颇有影响的事情，尤其是利玛窦，他努力学习华语，了解中国文化，在传教的同时传播西方的科技知识，并在肇庆绘制了第一张中文版的世界地图，王泮为地图题写“山海舆地全图”，为发展中西文化交流起了积极的作用。
是年六月，澳门天主教会范礼安任命孟三德为中国教区区长，计划加派孟三德麦安东来肇庆加强传教力量，命罗明坚帮助办理两人入境手续。王泮只批准一人来肇小住几日。结果罗明坚趁总督托他到澳门买翎毛之便，把孟三德带到了肇庆，并赖着不走，王泮只得同意孟三德留下来，但声明人数不得再增加。同年底，王泮升任岭西分巡道，仍驻守肇庆。罗明坚为了开辟新的传教点，取得新任知府郑一麟的支持，安排麦安东假扮商人混进广州。第二年，麦安东与罗明坚一起到王泮的家乡绍兴活动达半年之久。
罗明坚的行为引起王泮的不满，他以现任两广总督吴文华不乐意外人居住为由，下令传教士返回澳门。罗明坚自感难以再呆下去，于万历十六年(1588年)六月回到澳门，由利玛窦主持肇庆的教堂事务。同年秋天，王泮升任湖广布政使，离开了肇庆。
由于明代两广总督府对澳门执行了正确的政策，明代澳门对外贸易出现前所未有的繁盛，给中国和葡萄牙都带来很大的经济效益，促进了中葡两国以至西欧、东南亚、拉丁美洲各国的社会经济发展，为明代以后的中外交往史写下十分重要的一笔。
乾隆十一年，两广总督府迁往广州，肇庆发展的黄金时代宣告结束。鸦片战争后，随着香港的开埠，澳门的地位也一落千丈。虽然新的岭南双城逐渐由肇庆与澳门演变为广州与香港，但两广总督府时期的肇庆为岭南和中国历史所作出的贡献是永远都不能抹杀的。